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PCR生物芯片/微装置在微生物检测中应用研究

PCR生物芯片/微装置在微生物检测中应用研究

2006/5/30 8:37:00
摘 要:聚合酶链式反应(PCR)技术已经在分子生物学、生物化学、临床医学、遗传以及法医等领域得到广泛的应用。基于微电子机械系统技术开发而成的PCR生物芯片由于具有所需样品和反应混合物体积小、反应时间短、轻便等优点而日益受到人们的重视。介绍PCR生物芯片/微装置(包括反应池内固定扩增式和连续流动式)在微生物埃希氏大肠杆菌(E.coli)和微生物战剂检测中的应用。 关键词:聚合酶链式反应生物芯片/微装置;微生物;检测 0 引 言 早期PCR装置通常具有较大体积和热容,所需生物样品体积较大,反应速度也受到很大限制。然而,随着微电子机械系统(microelectromechanical system,MEMS)技术的不断发展,在20世纪90年代中期,Wilding等人就成功在硅芯片上完成反应池内PCR扩增反应,反应池体积仅5~10uL,所需DNA样品和反应混合物大大减少;在20世纪如年代后期,Kopp等人在玻璃芯片上刻蚀出微通道作PCR反应池,矩形通道呈逶迤形,它具有体积小、温度变化速率快等优点,20个循环只需18.7~1.5min。目前,反应池内固定扩增式PCR和连续流动式PCR已经成为芯片上PCR扩增的2种主要形式。 PCR生物芯片/微装置可以对来自于水样、土样或气样中的微生物进行及时的、快速的检测。肠杆菌科(Enter-obacteriaceae)细菌广泛分布在水和土壤中,其中,与医学有关的典型细菌是埃希氏菌属(Escherichia)的代表种埃希氏大肠杆菌(E.coli),它能引起肠道外感染、急性腹泻等,环境科学家们已开始建议:对E.coli的检验和分析也许能很好地指示水、土壤以及食品的污染程度,对水的质量及时检测能有助于提高人们的生活质量。还有,微生物战剂已经被一些恐怖分子甚至国家应用到战场中,在它们中有成千上万种都能引起人类疾病感染,被认为是潜在的生物武器。目前,有11种微生物战剂很可能被人们使用,排在前面的有4种:天花(smallpox)、鼠疫(plague)、炭疽热(anthrax)以及肉毒杆菌中毒(腊肠菌病)(Botulism),其中,对人类危害性最大的是炭疽热和天花,它们可能分布于与人类生活密切相关的水、土壤或空气中,对它们进行及时、快速检测更具有重要的战略意义。本文主要介绍自1999年以来反应池内固定扩增式和连续流动式PCR生物芯片/微装置在检测微生物E.coli和微生物战剂中的应用。 1 固定扩增式PCR生物芯片/微装置对微生物的检测 1.1 对微生物E.coli的检测 Yang等人开发一种聚碳酸酯(polycarbonate,PC)微PCR反应装置,在同一PCR反应体系中,对致病性微生物埃希氏大肠杆菌K12(E.coli K12)(病原体模型有机物)、粪肠球菌(E.faecalis)、唾液链球菌(S.salivarius)以及表皮葡萄球菌(StaPh.epidermitis)实行四元PCR扩增分析,E.coliK12的扩增初始浓度低到10E.coli细胞,而且,E.coliK12特异性基因片断(221碱基对(base pair,bP))在2%血样存在的条件下也能得到很好的扩增,因而,具有较高的检测灵敏度和检测特异性。这种PCR芯片采用了宽为1.5mm、深为0.25mm,容积为40uL的“蛇型”反应通道。和直反应通道相比,这种PCR芯片结构一方面可以减少微流体传输过程中的死体积产生和气泡生成;另一方面,也可以提高具有微小芯片尺寸的既定加热面积上的检测体积。但是,该PCR反应装置为了克服PC具有较小导热系数的缺点而采用2个珀耳帖加热元件、2个铝冷却肋片以及2个冷却风扇,尽管取得较高的加热速度(7~8℃•s-1)和冷却速度(5~6℃•s-1),30个PCR扩增循环仅需30min,但是,整个PCR芯片装置占有较大的空间体积,集成化程度较低。 最近,美国农业部农业研究署(USDA-ARS)的动物废物病原体实验室的Higgins等人开发一种到目前为止重量最轻的手持式高级核酸分析仪(handheld advanced nucleic acid analyzer,HANAA),重量小于1kg,共有4个模块(35mm×10mm),每个模块含有由硅热循环单元和Pt加热单元构成的反应池,它能容纳反应容积为25~30uL塑料PCR试管。通过12V电池来提供能量,能同时对高达4个样品通过SYBR绿染料或TaqMan探针进行荧光实时定量PCR。采用该装置对E.coil、草原居民欧文氏菌(Erwinia herb cola,E.herbicola)以及炭疽热细菌(Bacillus anthraces,B.anthracis)(下面将进一步讨论)进行实时定量扩增分析。他们除了成功对lac Z基因片断进行实时定量扩增外(DNA从E.coli(培养于溪水样中)的肉汤培养液中提取),还对从非致病性的E.coli菌株11775和0157:H7的混合培养液中提取的DNA片段(Tir基因和lac Z基因)进行实时定量扩增分析。这种HANAA的最大优点是容许研究人员能够快速地、便携地、用户界面友好地进行实时定量PCR扩增分析,缺点是DNA样品通过脱线(off-line)提取,过程复杂。 1.2 对微生物战剂的检测 1999年,Belgrade等人报道一种便携式高级核酸分析仪(advanced nucleic acid analyzer,ANAA),这种装置的核心部件是微加工而成的硅热循环池,注入样品的薄壁聚丙稀试管插入到硅池中,这些塑料试管能容纳最大的液体样品体积为25uL。他们用7min热循环检测出E.herbicola的结果,所用的热循环时间为变性、退火和延伸各1s,热循环周期为17s,循环次数为25次,总时间为7min,所用的检测技术为5′端和3′端分别连接6-羧荧黄(6-FAM)、四甲基罗丹明(TAMRA)荧光染料的TaqMan探针技术。同年,他们又开发一种微型声处理装置来快速破碎枯草杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)菌孢,并通过实时定量PCR来检测这些超声处理过的菌孢,结果发现:微型声处理装置的应用能改善PCR分析,减少了检测极限和检测时间,并提高了信号幅度,孢子破碎和微芯片PCR检测所需要的总时间少于15min。致病性微生物样品B.subtilis模拟炭疽杆菌(B.subtilis)(炭疽热),炭疽热是由于感染到一种称为B.anthracis的细菌所引发的急性病,它通常感染一些草食动物,如牛、羊等,人类如果接触到含这种菌孢的动物及其排泄物也会发病。B.anthracis是一种革兰氏阳性杆菌,在严酷的环境中能生成孢子,可以在干燥的环境中能存活数十年,因而很容易被传递而利用为一种生物战剂。 2001年,Belgrade等人开发一种紧凑的、实时定量PCR装置,并以廉价的、便携的方式进行快速的、多元化核酸分析。该装置重3.3kg,尺寸为26cm×22cm×7.5cm,主要由笔记本电脑、2个集成了光学系统的反应模块(用于4色荧光检测)、电池以及电池充电系统等组成,它可连续运行工作4h。在该PCR装置上通过多元定量分析来鉴别杆状细菌——B.subtilis和转苏云金杆菌(Bacillus thuringensis,B.thuringensis)。多元定量分析包含两对引物和2个荧光探针,即B.subtilis特异性探针和B.thuringensis特异性探针,所用的探针5′端分别连接荧光染料FAM和JOE(二氯二甲氧荧黄),3′端都连接猝灭染料TAMRA。10min后(即25次热循环后)在通道1(Ch.1)和2(Ch.2)中能分别鉴定出B.subtilis和B.thuringensis,每个探针之间彼此特异性很强,检测通道间没有发生交互式污染。这种装置体现了快速的PCR分析,能提高对生物恐怖活动的防御能力。 2 连续流动式PCR生物芯片/微装置对微生物的检测 2.1 对微生物E.oli的检测 Sun等人在石英玻璃衬底上开发一种透明的连续流动式PCR微芯片,在PCR芯片上通过两步热循环(即94和67℃)对E.coliHB101(450bp)进行扩增,并通过荧光分光计对PCR实时定量分析。这种PCR芯片的优点是微通道芯片、芯片盖片以及沉积在芯片底部的加热薄膜和温度传感薄膜都是透明的,它们分别是石英玻璃以及铟锡氧化物(indium tin oxide,ITO),这样便于检测PCR扩增过程以及测量微通道中的温度分布。而且,连续流动式PCR扩增芯片具有较高的热转换速率以及较小样品消耗等优点。然而,它的缺点是通过脱线方式对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶分析,集成化程度低。 最近,Fukuba等人开发一种基于MEMS技术制造而成的连续流动式DNA扩增装置,该装置是由玻璃衬底的温度控制芯片(ITO薄膜加热元件和Pt薄膜温度传感元件)和弹性体聚二甲基硅氧烷(polydimethysiloxane,PDMS)衬底的微通道芯片构成的,微通道深为100/μm、长为3033mm,其中,解链、退火以及延伸区的长度比为2︰2︰3。在该装置上直接对来自于E.coli基因组DNA的580bp16SrRNA基因片段以及来自于未经处理的细菌1460bprRNA基因片段进行PCR扩增,并研究了不同流速对扩增产物的影响,实验结果表明:该微型装置的扩增产量达到甚至超出传统的热循环装置的扩增产量,尽管扩增产物的数量随着流速的增加而减少,但是,非特异性扩增引起的非特异性DNA片断的消失证明:该PCR芯片的特异性有所改善。不仅如此,扩增产物还可用于微生物群体遗传多样性的16SrRNA—限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析。在这种连续流动式PCR微装置中温度和流体控制显得尤为简单,因此,很适合现场使用。如,它可以应用到每毫升少于106个微生物的实际环境中,而且,可以对不同环境样品进行连续分析。 2.2 对微生物战剂的检测 2003年,Belgrader等人开发一种可反复使用的连续流动式实时定量PCR微装置,PCR反应池由内径为0.762mm聚四氟乙烯管组成,塑料管也由具有固态荧光检测的硅电阻加热元件包埋,通过该装置实时定量检测B.anthracis基因组DNA的扩增产物。这种PCR装置的优点是消除了样品间携带问题,而且,具有高的可重复性、敏感性(<3拷贝数)及效率(96.5%),这也是评价连续流动式PCR热循环装置性能的重要标准。 3 结束语 PCR生物芯片/微装置技术虽然还处于早期发展阶段,但在微生物检测中已展示出潜在的应用前景。综观近5年有关PCR生物芯片/微装置在微生物检测中应用的文献报道,可得出以下几个结论:(1)芯片制作材料的选择已逐渐由硅/玻璃转向聚合物材料;(2)PCR芯片趋向集成化,将样品制备、PCR扩增以及检测等步骤集成在单一的芯片上,形成所谓“芯片实验室(lab-on-a-chip)”;(3)伴随PCR<
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