石英晶体生物传感器在精密测量中的应用（下）

2 在医学诊断中的应用 2．1石英晶体免疫传感器 石英晶体免疫传感器属于质量响应型传感器，它是在石英晶体（金或银）电极表面固定一层抗体或抗原活性物质，在液相中通过免疫反应，固定的抗体（或抗原）分子能识别其相应的抗体（或抗原），并特异性结合形成免疫复合物，沉积在电极表面，引起电极表面负载质量的改变，该变化通过石英晶体谐振器转变为石英晶体振荡频率的变化△f，根据Sauerbrey方程可计算出被测物的质量△M。免疫传感器的检测过程可用图2表示。免疫传感器能弥补常规免疫检测方法不能进行定量检测的缺点。此外，它还能实时检测抗原抗体反应，同时，把反应信号连续记录下来，有利于进行抗原抗体反应的动力学分析。因为抗原抗体的结合具有很高的特异性，从而减少了非特异性干扰，提高了检测的准确性，并具有较大的检测范围。 图2 石英晶体免疫传感器检测过程 2．1．1 微生物的检测 检测微生物的关键在于提高选择性和灵敏度，石英晶体生物传感器在这方面具有显著的优越性，已被用于对多种细菌和病毒进行检测。 （1）白色念珠菌的检测 检测时，将石英晶体芯片浸入可疑样品液中，由于免疫吸附念珠菌，晶体表面的质量增加，使测得的石英晶体的谐振频率减少，并获得了线性范围。而且，在相同的混合液中对酵母菌无响应，所以，能够鉴别这2种真菌，具有一定的特异性。 （2）病毒的检测 石英晶体免疫传感器的出现为病毒的快速诊断提供了一种崭新的手段。例如：将人类免疫缺陷病毒（HIV）某抗原表位的人工合成肽固定于石英晶体电极表面，可检测体液标本中的抗HIV抗体。如，被测标本中含有抗HIV的单克隆抗体，则会与大分子蛋白肽链发生反应，引起石英晶体电极表面质量增加，从而导致晶体谐振频率降低。也有采用人工合成单纯疱疹病毒、水痘—带状疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒等的各自特异性抗原肽，制备相应的单克隆抗体，单克隆抗体通过蛋白A固定在10MHz的石英晶体金电极表面制成免疫敏感膜，检测样品中的病毒颗粒。用该方法检测病毒，线性范围可达5×104~1×109个病毒。 （3）肠道菌的检测 通过蛋白A将抗肠道细菌共同抗原的单克隆抗体包被在10MHz的石英晶体表面，进行肠道细菌的检测，菌液浓度在106~109个／ml范围内可引起晶体频率的明显改变，通过测量频率变化可测出肠道细菌的数量。Park等人利用Sulfo-LC-SPDP试剂来促进巯基化沙门氏菌抗体和石英晶体表面金膜层的相互作用，从而提高了检测的灵敏度和特异性，可检测的菌悬液浓度范围为9.9×105~1.8×108个／ml集落形成单位。 2．1．2 体液蛋白质的检测 （1）激素的定量检测 Suri等人研制了一种可检测胰岛素的免疫传感器，把胰岛素的特异性抗体通过蛋白A固定在石英晶体电极表面，检测血液中胰岛素的浓度，最低检测限为1ug／L。 （2）免疫球蛋白检测 免疫传感器常用于定量检测人的免疫球蛋白，如，IgA，IgG，IgM，IgE等。用IgA，IgG，IgM，IgE的抗体固定在石英晶体金电极表面制成免疫识别敏感膜。Su等人设计了一个检测系统来检测血清标本中IgE总量。将IgE抗体以生物自组装方式固定于10MHz的AT切向石英晶体金电极表面，传感器的检测范围为5~300IU／ml。传感器用尿素和甘氨酸再生后可重复使用5次，其灵敏度和特异性无明显下降。Suri等人用9MHz的石英晶体以鱼精蛋白作为分子识别元件研制了检测IgM的免疫传感器，检测范围可达5~93ms／L。 2．2 石英晶体DNA传感器 石英晶体DNA传感器属于质量响应型传感器，它以石英晶体谐振器为换能器，在石英晶体电极区表面固定ssDNA探针，然后，浸入含有被测目标DNA分子的溶液中，在溶液中电极表面的ssDNA探针与互补序列的目标ssDNA分子杂交，形成dsDNA，引起石英晶体谐振器的振动频率发生变化，振动频率随电极表面上的质量增加而减小，灵敏度可达到亚纳克级，通过检测频率的变化达到测量的目的。如，采用AT切割的基频为9MHz的石英晶体作为换能器，并在晶体的表面蒸发100Hm厚的Au薄膜作为电极，ssDNA探针通过巯基结合在电极表面，1ug的物质附着在晶体上可使振动频率减少0.95Hz。Fawcett等人通过研究提出：固定在石英表面DNA分子杂交后会引起谐振频率的明显变化，当用9MHz的AT切向石英晶体表面结合的poly（U）与溶液中位点互补的poly（A）互补杂交时，谐振频率显著下降，约下降500Hz，从而可对核酸的相互作用进行研究，该研究为DNA生物传感器的发展做出了开创性的贡献。Zhou等人报道构建石英晶体DNA传感器，用于遗传性地中海贫血的突变基因诊断。Erdem等人报道将亚甲基蓝嵌入双链DNA分子中并保持其电化学活性，利用差分脉冲伏安法识别特定的DNA分子。Su等人在石英晶体表面固定DNA，用于检测抗癌铂药物的含量，检测限为10-1mol／L。石英晶体DNA传感器能准确诊断血清中的HBV病毒基因，实验表明：当样品中含有HBV时，石英晶体的频率改变量平均为312.4Hz，变化很显著，灵敏度高；而当样品中不含有HBV时，石英晶体的频率改变量平均为83.8Hz，这是由于非特异性吸附所引起的。因此，可用石英晶体DNA生物传感器直接检测乙肝病毒基因。DNA传感器还可用于表面杂交过程的动力学研究，并为DNA传感器的优化提供依据。石英晶体DNA传感器在基因诊断领域具有极大的优势，工作原理是基于石英晶体谐振对其表面质量变化敏感的原理，在晶体表面固定大量特异的寡核苷酸序列，利用其与溶液中互补的核酸序列发生杂交反应，导致晶体表面微质量改变来检测特定的靶基因序列，石英晶体DNA传感器可望广泛应用于基因分析和肿瘤早期诊断。 2．3 石英晶体凝血传感器 石英晶体凝血传感器属于非质量响应型传感器，是利用石英晶体振荡频率变化对晶体所处体系密度和粘度变化的高度敏感性来检测体系性状的改变。凝血传感器通过红细胞阻抗特性的变化引起传感器的响应来检测红细胞凝集时间和沉降速率。其工作原理为：当红细胞凝集或沉降特性改变后，将导致溶液电导率的变化，通过检测石英晶体的频率改变可反映红细胞凝集时间和沉降速率。国内有学者曾通过实验研究了红细胞变形性、渗透压和溶液中其他大分子物质对检测的影响，经与常规方法对比，证明该方法灵敏度高、能排除热效应干扰、检测时间短、结果一致性好。 3 在环境监测中的应用 石英晶体生物传感器因其特有的一系列优点，在环境监测领域获得了较大的进展，如，农作物上残留的杀虫剂和丁业污染物的检测。这类传感器实用化的重点将是进一步提高检测的选择性，石英晶体生物传感器在环境监测中具有很大的发展前景。农业生产中，广泛使用的除草剂和杀虫剂的残留物会对水源和土壤造成污染，因此，如何迅速准确测定残留物的浓度以保证农作物的生长是环境监测的一个重要方面。Steegbron等人研制了检测除草剂at-razine的石英晶体免疫传感器，其工作原理是：通过竞争分析来检测水中的atrazine浓度。将有生物活性的atrazine以白蛋白分子为间隔分子固定在石英晶体的金膜表面，然后，把石英晶体放在流动检测池中，流动池内的反应缓冲液加有过量的atrazine单克隆抗体，固定的atrazine和待测液体中游离的atrazine与其单克隆抗体竞争结合，通过检测石英晶体频率降低程度来间接反映待测液体中的atrazine浓度。该方法检测灵敏度高，经处理后石英晶体还可重复使用。通过与计算机联用，可实现检测的实时性、连续性、自动化。Guilbauh等人以金蛋白包被晶体作为固体底物与绵羊抗莠去津抗体结合建立了测定饮水中莠去津的测定方法。使用时将晶体置于含莠去津的溶液中，以非特异性抗体包被的相同晶体作为参比进行测量，检测的范围为0.03—100μg／L，该方法的相对标准偏差为8％。Ngeh-Ngwaimbi等人用抗对硫磷抗体包被的石英晶体生物传感器测定对硫磷，检测限为36μg／L。 4 在食品工业中的应用 食品如果被细菌毒素污染，则食用后会对人体造成很大的危害，甚至危及生命。因此，对细菌毒素的检测是食品卫生检验常用的重要指标。Harteveld等人研制了一种可以检测金黄色葡萄球菌的肠毒素B的石英晶体免疫传感器。将金黄色葡萄球菌的肠毒素B的多克隆抗体固定在20MHz的石英晶体金电极表面采用流动注射技术进行检测。最低检测限可为0.1mg／L。该方法能进行实时检测，检测方便、快捷，是一种简单可靠的食品卫生检测手段。 石英晶体生物传感器具有可实时检测、灵敏度高等特点，在食品、酿酒、饮料等生产流程各环节的实时监测中起了重要的作用。WuTzong-zeng研制了一种检测不同气体的石英晶体生物传感器。用9MHz的金膜石英晶体，把从牛蛙中分离得到的嗅觉受体蛋白固定在金膜表面来检测挥发性液体，如沉香醇、乙酸等，传感器的灵敏度可达到10-7g，与人嗅觉的阈值水平一样，故被称为“电鼻子”，从而为酿酒和白酒的勾兑提供了新的方法。 5 展 望 石英晶体生物传感器正处于开发阶段，其研究和应用从最初只应用于气相检测到现在几乎涉及到了各个领域，目前，研究重点正集中在对液相条件下传感器的灵敏性、特异性的研究；寻找不同待测物有效、快速的识别元件和该元件合适的固定方法等方面的研究。日本的Aizawa等人采用一种新的凝胶压电免疫测定法，使用固定有抗原—抗体的凝胶颗粒，省略了一般免疫传感器必需的抗原—抗体固定步骤，其原理是这种凝胶颗粒能和血清中相应的抗原—抗体反应，使颗粒发生凝聚，灵敏性和特异性和有固定化过程的方法相似。Aizawa等人用此方法检测了血清中的CRP，ASLO，RF等，并于2001年成功地用于血清中梅毒抗体的测定。随着微细加工技术的不断发展，微型化、阵列化程度将不断提高，石英晶体阵列化、多通道液相实时检测将成为石英晶体生物传感器的发展方向。石英晶体生物传感器操作简便快速、价廉、体积小、携带方便、易于实现自动化等独特优越性使其具有广阔的应用前景和巨大的潜在价值，<