PCR-DGGE在造纸废水微生物检测中应用

造纸工业的迅速发展造成了严重环境污染，利用生物处理技术来降解污染物是制浆造纸废水中的最重要的方法之一，但目前的研究主要几种在处理工艺的选择及工艺参数的和设计参数的优化，面对其中微生物的研究涉及很少。但生物处理系统中微生物的种群结构以及微生物多样性，结构稳定性和功能稳定性在污水处理系统有效性中起着重要作用。研究水处理工艺中微生物的组成结构、数量以及多样性对于提高废水生物处理效果，研究生化反应的机理，、污染物降解和转化途径具有非常重要的意义。但是传统的微生物法用于环境生物学研究时环境中只有不超过10%的微生物可以培养，并且由于常规检测方法受到采样和分析条件的影响，不仅检测时间厂，结果准确率差，而且有些种类分离比较困难。因此，传统的方法不能充分揭示微生物群落多样性的变化来迅速判断环境的变化。 　　近年来，分子生物学的迅速发展使得微生物不需要经过长时间的分离培养，而直接从样品里提取DNA来对复杂微生物生态系统进行研究，能够快速反应生物学方法具有简便、快速、灵敏、特异等优点已被广泛采用，主要的方法有核酸探针杂交检测方法、荧光原位杂交（FISH）、聚合酶链式反应（PCR）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）和脂肪酸指纹法等。将PCR-DGGE结合起来可以使我们能够快速、准确地鉴定微生物个体，并进行复杂微生物的群落多样性和动态性、特殊基因的跟踪与表达的分析，尤其适合对不同的研究对或者不同时空的某一对象内微生物的组成分析，已被广泛应用于生物、环境、食品、医药等微生物的检测中，但是在制浆造纸废水处理微生物的检测中的应用在国内还鲜见报道，将其应用于制浆造纸废水处理的微生物检测中有助于理解微生物的作用机理，对制浆造纸废水的处理具有非常重要的意义。 　　1 PCR-DGGE的发展 　　20世纪70年代初，Kteppe等就提出了PCR的工作原理。1985年Cetus公司的Mullis等建立了一套大量快速扩增特异DNA片段的系统，获得了大量染色体DNA单拷贝基因，但是使用的大肠杆菌DNA聚合酶Klenow不耐热。1988年，Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌中提取到耐热的TaqDNA多聚酶，并引入了PCR系统，结果发现TaqDNA聚合酶经过多次循环后仍具有活性，反应体系可以自动往复多次循环后仍具有活性，反应体系可以自动往复多次的对所需DNA片段进行酶促合成。1993年，Mullis采用定向酶促扩增法选择性的富集某一特异性DNA序更10的六次方倍，可以从100万个细胞中检测到一个靶细胞。自此，PCR技术就开始就开始在各个相关领域得到了迅速而广泛的应用。 　　DGGE是由Fischer和Lerman最先提出的用于检测点突变的一种电泳技术，1985年，Myers等首次采用“GC夹板”技术并使用异源双链技术，Sheffield等于1989年将“GC夹板”技术与PCR技术相连接，1993年Muyzer首次将其引入分子微生物学的研究中。目前PCR-DGGE已经成为一项常规的分子生物学研究方法，在微生物群落结构和多样性分析上有广泛的应用。 　　2 PCR-DGGE的原理和特点 　　PCR是一种体外酶促扩增特异DNA序列的技术，是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。PCR反应包括模板DNA链的热变形、引物退火复性和在DNA聚合酶作用下引物的延伸三个阶段。模板DNA加热到94摄氏度左右反双链解离成单链，在一定的温度下，两个人工合成的寡核苷酸引物分别与模板DNA的两条链互补结合，结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，按照碱基配对与半保留复制的原理，合成一条新的与模板DNA链互补的链。由于反应循环可以进行一定次数（通常为25-30个循环），所以在短时间内就可以获得大量目的基因。 　　DGGE可分离长度相同但是碱基不同的DNA片段的混合物，DGGE胶在聚丙烯酰胺胶中添加了线性梯度的变性剂甲酰胺。，这样就可以形成从低到高的线性梯度。通常采用琼脂糖凝胶电泳来检验PCR的结果。将PCR和DGGE结合起来在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基对，分辨率较高。染色后的凝胶用成像系统分析可以在一定成都上反应样品的复杂性。条带的多少能反应样品中微生物组成的差异，条带的亮度能反应样品中微生物的多少。由于PCR-DGGE具有以上优点，目前该技术在微生物群落结构的分析和动态研究方面得到了广泛应用。 　　3 PCR-DGGE在环境微生物检测中的应用 　　制浆造纸废水中含有大量的糖类、木素等有机化合物，通常采用活性污泥法来降解污染物，将PCR-DGGE用于活性污泥中微生物的研究已经有很多报道。Marsh等利用PCR-DGGE分析并获得了油菜花活性污泥中真核生物的种群变化情况，王峰等采用PCR-DGGE技术对城市污水化学生物的絮凝处理中活性污泥和生物膜中微生物种群惊醒了分析，结果表明活性污泥培养前后微生物种群结构发生了很大的变化。 　　制浆含氯漂白的过程中会产生多种有机氯化物，尤其是产生的氯代酚类具有很强的毒性、致癌、致畸、致突变性，很难生物降解，因此筛选出降解这些物质的优势菌并理解他们的作用机理具有非常重要的意义。任艳红等采用PCR-DGGE技术对降解五氯酚的厌氧生物反应器中微生物群落结构进行了研究，结果表明随着PCR负荷的与污泥的颗粒化，污泥真细菌和古细菌组成都发生了变化。 　　PCR-DGGE不仅仅用于废水活性污泥中微生物的检测，在土壤和其他方面也有广泛应用。Mphekgo p.Maila等研究了地理未知和碳氢化合物污染两种因素对土壤微生物的群落结构和功能的影响，结果显示污染物对微生物造成的影响更大。赵璇等研究了被氯酚污染的土壤中微生物群落的变化，发现未受氯酚污染和受氯酚污染的土壤中有共同的DNA谱带，但强度有显著差异。 　　此外，PCR-DGGE还可以用于检测细菌和跟踪某些细菌的基因。Nicolaisen等利用PCR-DGGE技术发现Nitrosomonas-like细菌是商流式好氧流化床颗粒污泥中的主要氨氧化菌。刘新春等应用PCR-DGGE方法，对在相同的操作条件下分别用低温菌和常温菌家中的两套活性污泥系统中的微生物群落结构的动态变化进行了追踪。 　　4 PCR-DGGE技术的发展前景 　　由于PCR-DGGE技术无需长时间的培养，准确率高，快速简便，能克服传统方法分析微生物群落的限制，目前已经成为微生物分析技术的一种重要手段。但是PCR-DGGE存在可分析的样品容量小、不能对样品中所有的DNA片段进行分离等局限性，为了充分全面的揭示微生物的群落结构，往往将DGGE与其他技术结合起来进行分析。将PCR-DGGE与其他分子生物学技术以及微生物学方法结合起来可以减少不同技术的弊端和局限性，综合各种技术的优势，可以更准确的揭示微生物群落结构和功能。将PCR-DGGE与其他技术联合起来，用于制浆造纸废水生物处理系统中微生物群落的分析，，对于揭示微生物降解污染物的机理有指导意义，并具有良好的应用前景。 信息来源于：中国纸业网