凝胶过滤剖析在低糖中的运用

        功能性低聚糖由于其独特的生理功能已被广泛应用于食品工业和饲料工业，而低聚木糖由于在理化性质、生物活性及使用量等方面的优势而倍受关注。此外，低聚木糖在医药（药品监管制度的重要性）工业和农业等领域也具有较广阔的应用前景。

　　目前，在研究开发低聚木糖产品时存在两个难题：一是缺乏低聚木糖单一组分的分析标准品；二是缺乏低聚木糖单一组分用于其生物活性的研究。解决这两个问题有助于制备分离出低聚木糖单一组分。南京林业大学在低聚木糖的分离和纯化方面已有研究，笔者对凝胶过滤层析分离低聚木糖的规律和特点进行了研究，以期为今后大量制备分离低聚木糖单一组分提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1试材

   　低聚糖由南京林业大学生物化工研究所提供。玉米芯经木聚糖酶定向降解后，经过一系列分离、提纯得到了含有不同聚合度低聚木糖组分和一定杂质的粗低聚木糖混合液。聚丙烯酰胺凝胶介质BioGelP4和BioGelP2均购自BioRad公司。　　     1.2低聚木糖的分离在洗净的3.0cm120cm层析柱顶端接上漏斗，关闭柱下端出口，调整柱温到48，加入相当于柱体积20的脱气超纯水。将经润胀并已除去细小颗粒的凝胶BioGelP4悬浮液沿柱壁缓缓加入层析柱，填充过程中要避免悬浮液溅起而产生气泡。

　　层析柱装填好后接上蠕动泵、自动收集器和超级恒温水浴槽进行层析柱的平衡。分离时吸取一定量经浓缩的低聚木糖液均匀滴加在凝胶表面，当糖液刚好进入凝胶表面后打开底部阀门，启动蠕动泵开始洗脱，同时打开下端阀门，当快要出糖时开始收集，每管收集3.6mL，采用DNS法直接测定各管收集液的还原糖含量。

　　低聚木糖的二次分离是在快速蛋白质液相层析系统（AKTAFPLC系统，Pharmacia公司生产）中完成的。层析柱为XK16/100，层析介质为BioGelP2，其装填方法和上述过程相似。以脱气超纯水洗脱，柱温48，采用280nm紫外线和示差折光检测器同时检测。

　　1.3分析方法（1）还原糖浓度的测定采用DNS（3，5二硝基水杨酸）法。

　　（2）低聚木糖的分析采用高效液相色谱（HPLC）法。其中木二糖标准样品购于Sigma公司，聚合度大于2的低聚木糖组分的含量按木二糖标准方程近似计算。

　　（3）糖基组成的分析。取一定体积的样品溶液于50mL三角瓶中，加入等体积的8H2SO4，在121下水解60min，用NaOH溶液将水解液中和至pH为6.57.0，以WatersSugarpakTM为分析柱，在WatersHPLC246E高效液相色谱上对水解液中的阿拉伯糖和木糖进行分析，其质量之比即为糖基比。

　　2结果与分析

　　2.1BioGelP4分离的还原糖浓度

　　为制备分离低聚木糖单一组分，同时了解低聚木糖单一组分的结构特点，以BioGelP4为层析介质对低聚木糖混合液进行了分离。脱气超纯水洗脱，柱温48，每管收集3.6mL.

　　最后对每管收集液采用DNS法测还原糖含量，收集样品号和还原糖浓度的关系见图1.直接测定各级分还原糖含量可初步判断经分离的各组分，即将粗低聚木糖混合液至少分成5个组分。由于该低聚木糖混合液中木二糖含量较多，因此推测组分1为木二糖组分。根据凝胶过滤层析按分子量大小依次分离各组分的原理，可以推测组分2为木三糖组分，后经电喷雾电离质谱分析证实了此推测。

　　2.2分离组分的特性分析

　　将4246号、3740号、2528号、1822号和1415号样品（分别对应组分1至组分5）分别合并，然后对各峰合并液进行HPLC分析，同时对各组分酸解后进行糖基组成分析，其中低聚木糖各组分的认定依据AminexHPX-42A分析柱特点和木二糖、木糖、阿拉伯糖标样。

　　组分1为纯度较高的木二糖，纯度高达98.18，阿拉伯糖基与木糖基之比仅为0.012，微量的阿拉伯糖来自于组分中混有的阿拉伯单糖，故木二糖中不含阿拉伯糖基。组分2的HPLC分析图谱中最高峰为木三糖峰，计算结果表明，组分2中木三糖纯度为88.54.该组分中阿拉伯糖基与木糖基之比为0.025，微量的阿拉伯糖基可能来源于其中未完全分离的阿拉伯单糖，故木三糖组分不含阿拉伯糖基。根据凝胶过滤层析原理，木四糖应在木三糖之前被洗脱出来，可能是由于木四糖含量较少，在3135号样品中只检测到微量的还原糖，据此推测组分3应为木五糖组分，电喷雾电离质谱分析证实了此推测。

　　组分3的HPLC分析图谱的峰型极不对称，这可能是因为该组分中含有带阿拉伯糖基侧链的低聚木糖同分异构体（即异质低聚木糖）。组分3中的阿拉伯糖基与木糖基之比为0.135，即阿拉伯糖基含量为11.89，其阿拉伯糖基含量明显高于组分1和组分2.由于阿拉伯糖单糖滞后于木五糖洗脱出来，故组分3酸解液中大量的阿拉伯糖不可能来自阿拉伯糖单糖，而是来自木五糖组分中所含的阿拉伯糖基侧链，因此组分3应为混有带阿拉伯糖基侧链的木五糖同分异构体。由于它们分子量相等，因此采用凝胶过滤层析无法完全分离。根据前面分析可以得出，组分4和组分5分别为木六糖和木七糖组分，HPLC分析表明，其纯度分别达到78.80和86.67，两组分的阿拉伯糖基与木糖基之比分别为0.102和0.300，这说明组分4与组分5中也不同程度含有阿拉伯糖基侧链，其中木七糖组分中含较多阿拉伯糖基侧链。

　　分别对应木二糖至木七糖；糖基比为阿拉伯糖与木糖质量比。

　　对各组分的HPLC分析可以看出，采用聚丙烯酰胺凝胶BioGelP4对粗低聚木糖混合液一次分离，可以得到纯度不等的低聚木糖单一组分。

　　由于木五糖至木七糖含有带阿拉伯糖基侧链的同分异构体，因此不能采用凝胶过滤层析的原理分离获得标准品。该酶解法制备的低聚木糖中所含的木二糖和木三糖不含阿拉伯糖基，可采用二次上柱分离的方法进一步提高木二糖和木三糖组分的纯度。

　　2.3木三糖组分的二次分离为了证实采用二次分离工艺提高低聚木糖单一组分纯度的有效性，试验以聚丙烯酰胺凝胶BioGelP2为层析介质，以AKTAFPLC为控制系统对木三糖组分的浓缩液进行了二次分离。

　　可以看出，以BioGelP2为层析介质可将木三糖组分分成多个组分，其中洗脱体积在50115mL的组分峰型不对称且280nm紫外线吸收较强，因此该组分为非糖杂质。洗脱体积介于115140mL的图谱峰型和木三糖组分的HPLC图谱相似，因此洗脱体积125mL处为木三糖峰。将此峰收集合并后进行HPLC分析，表明木三糖含量为94.19.说明BioGelP2可将木三糖组分中少量的木二糖和木三糖分离开来，并将木三糖组分的纯度从88.54提高到94.19.因此，采用二次分离的工艺能进一步提高混合液中木三糖组分的纯度，从而获得大量高纯度的木三糖组分。

　　3结论

　　（1）以聚丙烯酰胺凝胶BioGelP4为层析介质，可将低聚木糖液至少分成5个组分，得到的木二糖、木三糖、木五糖、木六糖和木七糖组分纯度分别为98.18，88.54，97.52，78.80和86.　　67.

　　（2）低聚木糖混合液中阿拉伯糖基含量为14.75，其中木二糖和木三糖为均质低聚木糖，不含阿拉伯糖基，而木五糖至木七糖中混有带阿拉伯糖基侧链的异质低聚木糖。

　　（3）以聚丙烯酰胺凝胶BioGelP2为分离介质，对纯度为88.54木三糖组分进行二次分离，其纯度可提高到94.19.